液相色谱柱

液相色谱柱是高效液相色谱（HPLC）系统的核心部件，其性能直接影响到被测物质的分离效果和测定准确性。因此，正确安装、活化、使用和维护色谱柱对于确保检测结果的可靠性至关重要。本文将为您提供全面的色谱柱使用与维护建议。
1.使用前的检查和须知事项
(1) 检查包装盒是否完整，盒子侧面有产品信息与自己购买的是否一致。
(2) 打开包装检查色谱柱表面有无伤痕，柱两端是否有塑料堵头完全封住。
(3) 查看盒内是否有检查报告及签名，检查报告中有详细记录，填料批号、货号、序列号及柱性能等参数。
2.色谱柱的安装
液相色谱柱通常会在柱身上标明方向，安装新色谱柱时，应确保连接管路与色谱柱所标明的方向一致，避免反冲。另外，连接管路尽量使用合适的细径管线，柱的两端连接端口务必平整。若接口不匹配，可能会导致柱效下降、峰形拖尾或渗漏等问题。

一、反相色谱柱（包括C18、C8、苯基）
使用方法：
1. 色谱柱出厂时都有存储液，使用时需用互溶试剂替换。
2. 使用前用洁净的水与乙腈冲洗系统，确保系统干净，不含任何缓冲盐和污染物。
3. 将新色谱柱入口端接上系统，出口端先不要连接，在低流速条件下0.2mL/min用纯乙腈润洗色谱柱（色谱柱时间长的话柱头两端储存液容易干），然后2分钟后流速升高到0.5，当溶剂均匀从柱口端流出，停泵，再将出口端连接到系统检测器上（这样可以避免气泡进入检测系统，并且可以快速达到平衡）。备注：如果是色谱柱粒径是3μm及以下的流速就减半，防止压力过高。
4. 同样先低流速开始0.2mL/min 逐步过渡到正常流速，待基线平稳后（5-10倍柱体积）换成流动相平衡，带基线平衡后开始进样。
5. 当流动相有缓冲盐或离子对试剂时需要确保柱内有充足的水，再此前用90:10（水：乙腈）充分过渡半小时以上，再换成流动相平衡，待到平衡好后再进样。
保存方法：
● 不含缓冲盐或离子对试剂项目：
使用流动相冲洗至基线平稳，换成乙腈：水=2：8冲洗半小时（流速1mL/min），再换成乙腈保护30分钟，最后色谱柱应使用堵头将两端密封。
● 含缓冲盐或离子对试剂项目：
使用流动相冲洗至基线平稳，换成乙腈：水=1：9冲洗1小时（流速1mL/min），再换成乙腈保护30分钟，最后色谱柱应使用堵头将两端密封。注意，缓冲盐容易析出，再使用前和结束后需要多用高比例水冲洗。
清洗再生方法：
色谱柱使用一段时间后容易出现各种问题：
1. 柱压升高：一般是柱头筛板污染（固体颗粒或强保留物），可以用溶解污染物的溶剂长时间的反向冲洗（低流速0.5mL/min）2小时以上，或者使用保护柱套；
2. 缓冲盐正确使用：缓冲盐溶于水却很难溶于有机试剂，使用后应该高比例水冲洗色谱柱；
3. 强保留物滞留色谱柱：其在色谱柱中一段时间积累后会产生额外的保留行为，引起峰变宽，拖尾柱效下降等，同时柱压也会不断升高而使色谱柱损坏。建议用50℃左右甲醇：水=1：3（流速1mL/min）冲洗1小时之后换成 3：1 再冲洗1小时。
注意事项：
进行实际样品分析的推荐步骤：
1. 确保流动相洁净，每隔24-48小时就应配置流动相，并经常清洗流动相溶剂瓶，以免流动相长菌，确保实验室水系统工作正常；
2. 确保样品不含颗粒杂质，如样品过脏或有微粒存在就不能直接进样，避免影响色谱柱寿命。一般需要先用滤膜过滤样品，建议用0.22μm滤膜；
3. 确保样品与流动相条件相兼容，进样后不会发生沉淀，通常使用流动相或比流动相洗脱强度弱的溶液（有机比列较低的）溶解或稀释样品；
4. 常规分析过程中，每针间隔若干针清洗柱内可能累积的污染物，完成分析后彻底清洗色谱柱，除去缓冲盐和污染物。

二、氨基柱和硅胶柱
使用方法：
●正相条件下使用：
1. 确保系统内不含缓冲盐，如果有则需要先除去管路中的缓冲盐；
2. 取下色谱柱，用二通管代替色谱柱连接好管路；
3. 用甲醇或乙腈以2.0mL/min冲洗15min，除去管路中的水；
4. 用异丙醇以2.0mL/min流速冲洗15min，除去管路中的甲醇或乙腈；
5. 取下二通管，换上色谱柱，用异丙醇以0.5mL/min冲洗色谱柱45min；
6. 换上纯正己烷作流动相过渡，以1.0mL/min冲洗色谱柱15min；（因为异丙醇的极性很强，哪怕是少量的异丙醇进入到流动相中都可能引起保留时间的显著变化）；
7. 换上分析流动相走基线，通常这个过程至少需要30min，基线平稳后进样。
● 正相体系换成反相体系的方法：
1. 取下正相色谱柱，用二通管代替色谱柱连接管路，用异丙醇以2.0mL/min冲洗15min；
2. 换上纯甲醇或乙腈，以2.0mL/min的流速冲洗10min。
●反相条件下使用：
氨基柱和硅胶柱出厂时通常保存在正己烷：异丙醇体系中，使用前先用异丙醇（0.2mL/min）过渡1晚，再用乙腈以0.5mL/min的流速冲洗3小时，后换成流动相冲洗1小时后待基线平衡后开始做样。使用氨基柱时需要注意，由于氨基柱需要过渡饱和，一般前面几针效果不一定能达到要求，所以多进几针饱和后就正常了。
保存方法：
●正相使用
1. 因为出厂时氨基柱和硅胶柱通常保存在正己烷：异丙醇体系中，所以正相条件下使用时可以直接用流动相跑基线。
2. 由于基质具有较强的吸附性能，为防止强保留物质在色谱柱中的存留，每天分析任务完成后，需用异丙醇以0.5mL/min流速冲洗色谱柱60min，最后保存在异丙醇中；
3. 长时间保存最好用异丙醇冲洗色谱柱后，用正己烷封存，然后拧紧两端的塑料筛头。
●反相使用
保存方法和反相柱相近，用乙腈冲洗1小时，如有缓冲盐用乙腈水和流动相比例接近冲洗1小时后换成乙腈冲洗40分钟。如短期不用，乙腈保存；长期不用时需依次用甲醇、异丙醇置换，最后用正己烷保存。
清洗再生方法：
●正相使用
第一步：异丙醇（5 倍柱体积）
第二步：50%乙腈水溶液（5 倍柱体积）
第三步：含 0.1% EDTA 的水溶液（10 倍柱体积）
第四步：0.2M 醋酸铵水溶液（20 倍柱体积）
第五步：50%乙腈水溶液（5 倍柱体积）
第六步：乙腈（10 倍柱体积，封存）
●反相使用（参照C18柱方法）
1. 柱压升高：一般是柱头筛板污染（固体颗粒或强保留物），可以用溶解污染物的溶剂长时间的反向冲洗（低流速0.5mL/min）2小时以上，或者使用保护柱套。
2. 缓冲盐正确使用：缓冲盐溶于水却很难溶于有机试剂，使用后应该高比例水冲洗色谱柱。
3. 强保留物滞留色谱柱：其在色谱柱中一段时间积累后会产生额外的保留行为，引起峰变宽，拖尾柱效下降等，同时柱压也会不断升高而使色谱柱损坏。建议用50℃左右甲醇：水=1：3（流速1mL/min）冲洗1小时之后换成 3：1 再冲洗1小时。
注意事项：
1、氨基柱和硅胶柱可以用于正相条件，也可以用于反相条件，但需要注意正相溶剂和反相溶剂往往是不互溶的，对这一点的忽略可能会带给使用者一些麻烦，对于新购买到的柱子，首先请注意打开分析测试说明书，了解柱子的保存溶剂。如果保存溶剂与将要使用的流动相极性不同不互溶就会造成色谱柱损坏，所以切换正反向流动相时请先用异丙醇过渡。过渡过程中注意因异丙醇粘度较大，会导致柱压很高，适当调低流速即可。如果要使用的流动相中还含有缓冲盐类，建议在用分析流动相之前，先用不含缓冲盐的同比例流动相过渡，这样可避免缓冲盐在分析柱内的析出。
2、氨基柱和硅胶柱用于正相条件，使用时需注意如下事项：
⑴ 因为出厂时氨基柱保存在正己烷/异丙醇＝99.5/0.5中，所以正相条件下使用时可以直接用流动相跑基线；
⑵ 由于基质具有较强的吸附性能，为防止强保留物质在色谱柱中的存留，每天分析任务完成后，需用异丙醇以0.5mL/min流速冲洗色谱柱60min，最后保存在异丙醇中；
⑶ 长时间保存最好用异丙醇冲洗色谱柱后，用正己烷封存，然后拧紧两端的塑料筛头